ABD活性因子最新研究：通过保护细胞谷胱甘肽对体外诱导产生的各种氧化应激发挥神经保护作用

氧化应激和线粒体功能障碍是多种神经退行性疾病潜在的病理生理学主要因素，其主要包括包括帕金森病，阿尔茨海默病与肌萎缩侧索硬化病（ALS）等[1–4]。例如线粒体呼吸链复合酶 I 缺乏，进而导致线粒体活性氧（ROS）增加在帕金森病多巴胺能神经元的死亡中起关键性作用[5, 6]。在阿尔茨海默病进展中，线粒体功能障碍和氧化应激先于特征性淀粉样斑块的沉积[7, 8]。在ALS中，铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)的突变形式大约导致了20%家族性ALS的发病，其积聚在线粒体中，触发这些细胞器的氧化还原状态的转变[9]。

上述研究结果有力证明了，氧化应激，尤其是线粒体中，在神经元死亡中起着关键作用，是神经退行性疾病的基础。谷胱甘肽（GSH）是一种内源性抗氧化肽，在预防氧化应激中起着关键的作用，从而起到保护线粒体和防止细胞凋亡的作用[10]。在许多神经退行性疾病中， GSH水平已明显下降，从而导致患者应对细胞中ROS增加的能力减弱[11–13]。事实上，在疾病的发生中，GSH的减少经常被先于其它病理特征被观察到，如帕金森病中复合酶 I 缺乏和多巴胺能神经元的丢失[14].。有趣的是，在GSH耗竭的体外研究表明，细胞内GSH水平降低能够概括疾病的病理学特征。例如，在多巴胺能PC12细胞系中，GSH合成缺陷导致细胞中GSH总量下降，进而导致线粒体呼吸链复合酶 I抑制，引起氧化应激与线粒体呼吸功能障碍，例如帕金森病[15]。同样的，稳定表达人类SOD1G93A 突变体的NSC34运动神经元细胞对比亲代细胞显示线粒体GSH含量显著的、有选择性的消耗，可以联想到家族性的ALS[16]。关于体外GSH消耗研究显示，神经元对氧化应激和线粒体功能紊乱的敏感，导致随后的ROS增加与细胞凋亡。这个结果在GSH消耗剂，丁硫氨酸亚砜胺以及铜诱导的原代皮层神经元凋亡研究中证实[17]。同样，TAR DNA结合蛋白43形成胞浆内包涵体，这是一个标志性的病理学改变在散发的ALS患者中被发现，在体外培养的神经元中GSH耗竭[18]。总的来说，这些研究表明，GSH耗竭在多种神经退行性疾病的进展和发病过程中起到至关重要的作用。

鉴于GSH耗竭和神经退行性疾病之间的显著关系，目前已有多项研究通过各项治疗提高GSH水平，探索其神经保护作用。这种治疗包括GSH的前驱物（N-乙酰半胱氨酸（NAC））和GSH单乙酯（GSH-MEE）（细胞渗透性形式的GSH）和转录因子诱导剂（核因子NF-E2相关因子2（Nrf2）），Nrf2参与转录调控γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶，是GSH合成的关键酶和限速酶[19]。其中有大量关于NAC的研究，结果表明NAC治疗在多种疾病模型中带来了益处。例如，NAC在鱼藤酮（线粒体呼吸链复合酶 I抑制剂）诱导的大鼠帕金森病模型中，通过降低活性氧生成，表现出显著的保护能力，通过降低ROS的生成，维持正常的GSH水平，最终防止多巴胺能神经细胞死亡[20]。在家族性ALS G93A突变的SOD1小鼠模型中，NAC延迟了疾病相关的运动障碍的发生，并显著延长小鼠的生存率，可能是因为它能够提高小鼠的GSH水平[21]。表现阿尔茨海默病多种病理特征的 SAMP8快速老化小鼠，对其应用NAC治疗，结果显示小鼠的认知能力提高[22]。另一项研究中利用GSH-MEE在帕金森病MTPT小鼠模型中应用，结果显示补充GSH-MEE能够提高脑内GSH水平，而GSH的增加与纹状体多巴胺水平的部分保留一致[23]。近来临床试验也评价了GSH鼻内给药对帕金森病患者的安全性和耐受性。最后，Nrf2的诱导或过度表达在帕金森，ALS和阿尔茨海默病的动物模型中表现出了相似的研究前景。在帕金森病的MPTP模型小鼠中，Nrf2在星形胶质细胞中的过度表达减弱了一种帕金森病表型的发展[25]。同样，在ALS小鼠模型的星形胶质细胞中，Nrf2的过度表达延迟了ALS的发生，提高了小鼠的生存率，如同使用化学Nrf2诱导治疗[26, 27]。相对而言，在伴有阿尔茨海默病的小鼠模型中，慢病毒Nrf2的过度表达显著改善了小鼠的学习缺陷，同时伴有淀粉样斑块的减少[28]。总之，这些研究表明，增加大脑中GSH水平可能是治疗和预防神经退行性疾病的一种可行的选择。

虽然目前的治疗策略已经显示出在这方面的能力的前景，然而由于像GSH-MEE 和NAC等复合物相对较低的稳定性和生物利用度，这些治疗的疗效被显著限制[23, 29]。此外，GSH-MEE需要直接注入大脑才能观察到显著的效果，因此，进一步限制了治疗人类疾病的疗效[23]。在当前研究中，我们探索了一种活性乳清蛋白补充剂（ABD活性因子）在几种体外氧化应激模型中的神经保护作用。ABD活性因子在先前的研究中被证实可以显著提高HIV和囊性纤维化患者血液和淋巴细胞中的GSH水平，由于其含有高浓度的活性乳清蛋白，内含半胱氨酸前驱物和胱氨酸。胱氨酸可以抵抗胰蛋白酶的水解，并能通过血液进入靶细胞，然后还原为两个半胱氨酸分子，作为合成GSH的必需前体。在这种方式下，ABD活性因子的自身稳定性提高了生物利用度，使得它可以作为一个半胱氨酸的输送系统。这是很重要的，因为半胱氨酸可以在胃肠道和血液中自发的分解而来，从而解决了其单独补充引起毒性的问题[33]。此外，由于ABD活性因子优越的稳定性使其不依赖于侵略管理系统，目前已观察到标准口服给药方案。这些独特的特性促使我们研究了ABD活性因子潜在的神经保护作用。

ABD活性因子，HA14-1，硝普钠（SNP），DL-丁磺氨酸（BSO），4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），β-微管蛋白单克隆抗体，FITC标记第二抗体

大鼠小脑颗粒神经元细胞(CGNs)从7日龄的Sprague-Dawley鼠幼崽中分离，培养6天后进行实验。细胞在ABD活性因子浓度为3.3%的培养基中预处理。

NSC34细胞在高糖的DMEM培养基中进行培养，NSC34细胞在暴露在H2O2或谷氨酸之前，优先用ABD活性因子预孵育24h。

将HT22海马细胞接种于六孔板上，在低糖DMEM培养基上孵育24h，随后在OptiMEM上用脂质转染法转染4h，转染后，OptiMEM基用DMEM培养基替代，细胞用ABD活性因子孵育24h。

采用GSH/GSSG检测试剂盒，细胞存活率测定采用Hayward生物测定系统，脂质过氧化检测丙二醛（MDA）

每个实验均采用双样本，重复至少三次，数据采用均数±标准差表示，数据分析采用单因素方差分析

开始原代小脑颗粒神经元在3.3%浓度的ABD活性因子培养基中进行孵育，以评估其补充可能带来饿潜在毒性。ABD活性因子主要包括五种成分：β-乳球蛋白、免疫球蛋白、α-乳清白蛋白，血清白蛋白，和乳铁蛋白[35, 36]。基于五种成分的比例，计算小脑颗粒神经元接受GSH前体物治疗的浓度。一般情况下，培养基中3.3%的ABD活性因子中包含85.3mmol胱氨酸和30mmol谷氨酰半胱氨酸，这两种物质均可以充当潜在的GSH前体物。但是，需要指出的是由于前体物包含在更大的蛋白质内，因此，不是所有的胱氨酸和谷氨酰半胱氨酸都可以被用于合成GSH。经过ABD活性因子处理的细胞，固定后用DAPI进行染色，分析细胞核形态学，与未经处理的对照组细胞相对比。此外，经过ABD活性因子处理的细胞在亮视野下观察显示，其相比未经ABD活性因子处理的对照组细胞保持一个健康的神经元形态，包括完整的突起和大的胞体。

结果表明ABD活性因子对小脑颗粒神经元没有明显的毒性。下一步，将经过ABD活性因子处理的细胞，暴露于Bcl-2抑制剂（HA14-1）下。先前研究证明这种bcl-2抑制剂能诱导GSH敏感的线粒体产生氧化应激，引起小脑颗粒神经元凋亡[37, 38]。HA14-1可以诱导明显的核固缩和微管破裂、细胞凋亡，同时大量耗竭GSH。ABD活性因子可以显著保护HA14-1诱导的小脑颗粒神经元凋亡，维持GSH水平。为了探索其保护机制，采用ABD活性因子和γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶抑制剂（丁硫氨酸亚砜亚胺，可以阻止GSH合成）联合培养小脑颗粒神经元24h。结果显示ABD活性因子不能针对HA14-1起到保护作用。此外，ABD活性因子 在HA14-1暴露下维持GSH水平的能力被丁硫氨酸亚砜亚胺抵消。

为了进一步探索ABD活性因子潜在的神经保护作用，用CuCl2诱导氧化应激模型。过量的铜与自由基诱导的脂质过氧化和线粒体复合物破坏有关[40, 41]。免疫荧光分析结果显示，相比只接受CuCl2处理的小脑颗粒神经元，经过ABD活性因子预处理的小脑颗粒神经元之后凋亡显著减少。ABD活性因子的抗氧化作用。脂质过氧化检测发现，经过ABD活性因子处理的小脑颗粒神经元中MDA含量显著减少，从而证实了ABD活性因子的抗氧化作用。

SNP是一种NO供体，可以引起线粒体跨膜电位的损耗，增加大脑皮质神经元和小脑颗粒神经元中线粒体ROS的产生[42, 43].。正如预期，SNP诱导的NO产生可以引起小脑颗粒神经元的显著凋亡，但是经过ABD活性因子预处理后，凋亡显著下降。凋亡细胞计数证实，ABD活性因子可以使凋亡减少大约80%。MTT 细胞活性检测显示，相比对照组，ABD活性因子预处理后小脑颗粒神经元的线粒体活性也明显增强。

铝是一种神经毒性的金属，体外和体内暴露，可以损害神经细胞的线粒体的结构和功能[44, 45].。AlCl3可以引起小脑颗粒神经元细胞核固缩和微管破裂，经过ABD活性因子预处理后这些影响显著下降，且已证实这种保护作用是由于半胱氨酸的补充造成的，而不是金属螯合。

H2O2诱导的细胞死亡是神经元系统中ROS毒性的经典模型，因为其产生的自由基与神经退行性疾病有密切的关系[46]。H2O2诱导的ROS产生可以引起NSC34细胞活力的明显下降，而ABD活性因子可以起到改善的作用。MTT细胞存活性测定显示，相比对照组只接受H2O2处理，经过ABD活性因子预处理后的NSC34细胞的线粒体活性得到保护。MTT检测显示，单独的ABD活性因子培养NSC34细胞，其活性没有显著的不利影响。

谷氨酸兴奋毒性被认为在神经退行性疾病的几种形式中发挥着重要的作用，其可以通过细胞凋亡和非凋亡机制导致神经细胞损伤和死亡。NSC34运动神经元样细胞通常不表达功能性谷氨酸受体，这是兴奋性毒性的主要介质。但是如果NSC34运动神经元样细胞暴露在血清撤离的条件下7天，其会达到半分化状态，表达功能NMDA受体。此后，细胞对谷氨酸的兴奋毒性变得敏感[47]。我们观察到谷氨酸/甘氨酸暴露导致血清撤离的NSC34细胞活性显著降低。MTT细胞存活性测定显示，相比对照组只接受谷氨酸/甘氨酸处理，经过ABD活性因子预处理后的NSC34细胞的线粒体活性得到保护。

β-淀粉样肽是衰老斑的主要成分，在阿尔茨海默病患者的大脑中形成，有假说认为这种淀粉样前蛋白异常加工形成的蛋白是神经元死亡和疾病发病的主要原因[48]。β-淀粉样肽诱导的HT22小鼠海马细胞凋亡增加，ABD活性因子处理后这种影响减轻。

目前，许多研究正通过积极的探索清除活性氧策略，增强GSH等内源性抗氧化防御系统的能力等作为治疗神经退行性疾病的方法。在本研究中，我们评价了ABD活性因子的潜在神经保护作用，ABD活性因子是一种富含胱氨酸的乳清蛋白补充剂，可以对抗体外的氧化应激。这种补充剂含有高浓度的蛋白质，如血清白蛋白，α-乳清白蛋白和乳铁蛋白。此外，直接的GSH的前体物：γ-谷氨酰半胱氨酸，存在于ABD活性因子产品的血清白蛋白中。ABD活性因子可以被当做半胱氨酸的传递系统，进而提高一些疾病的GSH水平，通常这些疾病把氧化应激作为一突出的潜在因素[31, 32, 49]。因此，在氧化应激起至关作用的神经退行性疾病中，ABD活性因子可能是一种有效的方法来提高机体GSH。为此，我们体外研究了ABD活性因子对多种物质诱导的氧化损伤的保护神经元作用。这种氧化损伤不但可以由线粒体功能障碍引起，还可以通过模仿神经退行性病变中的某些致病因素，例如减少bcl-2功能，增加一氧化氮或者金属离子毒性的水平引起。

GSH耗竭是神经退行性疾病中一个被广泛研究的现象。虽然有多种机制GSH可能被消耗，其中一个涉及Bcl-2的表达或者功能下调。Bcl-2表达增加可以导致细胞内GSH合成增加，流出减少[50, 51]。另一方面，Bcl-2基因的敲除可以导致组织GSH水平下降[52]。在目前的研究中，我们利用了bcl-2抑制剂（HA14-1）模仿Bcl-2功能丧失和评估ABD活性因子潜在的神经保护作用。先前的研究表明，HA14-1可以下降细胞内GSH浓度，诱导线粒体氧化应激和小鼠海马细胞凋亡[37, 38]。在这种条件下，ABD活性因子显示出强大的神经保护作用，可以对抗线粒体GSH耗竭和Bcl-2功能抑制诱导氧化应激带来的影响。此外，采用ABD活性因子和BSO阻断神经保护联合培养细胞发现，ABD活性因子对抗Bcl-2抑制剂的保护作用依赖于GSH的重新和成。

另一个影响神经退行性疾病发病的因素是铜毒性。GSH被认为在减轻铜毒性方面起到了重要的作用，它可以安全地将这种有毒金属储存在细胞内环境中[53]。GSH的耗竭破坏这一重要过程，伴随着ROS的产生，使神经细胞即使暴露在微量的铜中也较敏感[17, 54, 55]。因此，铜毒性可能是一个依赖于GSH耗竭的过程，在一些GSH水平降低的神经退行性疾病中，包括老年痴呆症和肌萎缩侧索硬化病，我们均可以观察到铜浓度增加和铜稳态失调[54, 56]。在我们的研究中，原代神经元细胞应用ABD活性因子进行孵育，增加了GSH水平，可通过抑制铜诱导的脂质过氧化作用，改善铜毒性，从而减少细胞死亡。

神经性炎症在小细胞胶质和星形胶质细胞中呈现炎症表型并分泌毒性因子，如NO，是神经退行性疾病的另一个重要组成部分[57, 58]。一氧化氮合酶（NOS）诱导产生NO炎症细胞触发神经元细胞死亡的一个重要机制[57]。帕金森病和阿尔茨海默病患者组织中硝化应激普遍发生，表明了NO在疾病发展中的重要作用[59, 60]。活性氮（RNS），如一氧化氮促进线粒体成分的破坏，可以导致线粒体膜电位损耗，进一步增加RNS和ROS的产生[42, 43]，进而加剧炎症反应，最终导致神经元死亡。GSH可以解毒RNS和ROS，使其成为必不可少的抗氧化剂和关键的神经保护分子。因此，ABD活性因子可以显著保护小脑颗粒神经元以免一氧化氮供体SNP诱导的毒性损伤。

铝暴露的神经毒性作用是有据可查的，最近，环境中的铝和含铝疫苗已作为神经退行性疾病的潜在原因而引起人们的注意。一般来说，神经细胞体外暴露铝，可以导致线粒体结构和功能的显著改变， ROS显著增加，线粒体酶活性降低，细胞死亡[45]。铝可以干扰NADP异柠檬酸脱氢酶的活性，减少GSH生成所必须的NADPH，进而降低GSH浓度[61]。铝神经毒性的体内实验表明，用氢氧化铝处理的健康小鼠表现出明显的运动障碍，并发展观察到与肌萎缩侧索硬化病相似的病理特征[62]。1990-1991年海湾战争的退伍军人中，收到过含氢氧化铝疫苗的肌萎缩侧索硬化病的发病率显著增加，提示铝毒性是某些散发性肌萎缩侧索硬化病的潜在环境因素之一[62, 63]。我们的实验表明，在小脑颗粒神经元细胞中，采用ABD活性因子预处理能够显著降低铝暴露引起的神经毒性程度。同时，我们进一步证实ABD活性因子的保护作用不是由于金属的螯合作用产生的。

为了确定ABD活性因子对小脑颗粒神经元的保护作用在其他神经退行性疾病中是可重复的，我们研究了补充ABD活性因子对NSC34运动神经元样细胞氧化应激和兴奋毒性的保护作用。NSC34细胞是一个杂交细胞系，由脊髓运动神经元和小鼠神经母细胞瘤细胞融合组成[64]。我们首先分析了ABD活性因子对H2O2诱导的NSC34运动神经元样细胞氧化应激的作用。ABD活性因子预处理NSC34细胞可以减少H2O2诱导的细胞死亡。我们下一步探索了ABD活性因子对NSC34细胞中兴奋毒性诱导的损伤的减轻作用。兴奋毒性在多种神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用，包括肌萎缩侧索硬化病，其与氧化和硝化应激密切相关[65]。ABD活性因子预处理NSC34细胞可以显著减轻谷氨酸兴奋性中毒的损伤作用。

最后我们评估了ABD活性因子对β-淀粉样蛋白（Aβ1-42）过度表达诱导的HT22小鼠海马神经细胞毒性的保护作用。正如前面所讨论的，一个Aβ1-42是老年斑的主要成分，是阿尔茨海默病的病理学标志之一。此外，这种蛋白质也可以在线粒体中积累为淀粉样前体蛋白，导致线粒体功能异常[48]。事实上，Aβ1-42在线粒体中的积聚在阿尔茨海默病患者和小鼠模型的大脑中均被发现[66–68]。我们的研究表明，采用ABD活性因子进行预处理可以显著提升HT22海马细胞的活力，暗示GSH补充剂是一个减少Aβ1-42毒性诱导细胞死亡的有效途径。

ABD活性因子的早期研究被应用到免疫系统缺陷和癌症临床疾病中，作为一种增加可利用的GSH的方法，增强细胞抗氧化和免疫系统防御能力。最近的研究探索了ABD活性因子在中枢神经系统疾病中的潜在治疗作用。口服ABD活性因子 45天已被证明可以提高非转基因小鼠的大脑GSH水平，相比用酪蛋白处理的对照组可以提高300%，暗示ABD活性因子可以直接影响中枢神经系统的抗氧化状态[69]。此外，我们的研究最近证明，在G93A突变的SOD1小鼠肌萎缩侧索硬化病模型中，口服补充ABD活性因子与未经处理的转基因小鼠相比，延缓了疾病的发生，显著增强了握力[70]。与对照组未经处理的转基因小鼠相比，这些治疗效果与血液和脊髓中的GSH水平相关，暗示ABD活性因子可以直接作用于神经中枢，保持神经退行性疾病GSH的水平。基于上述研究表明，在显著氧化应激状态的神经退行性疾病中，ABD活性因子可以作为一种新的增强GSH水平的治疗方法。未来进一步评估补充GSH前体物在神经退行性疾病的临床前动物模型和临床患者中的治疗益处。