最新权威发布：ABD活性因子在胰腺癌临床研究上取得重大研究成果！

近年来，全球恶性肿瘤的发生率不断增加，已成为威胁人类健康的主要因素之一，而接受放疗、化疗以及外科手术后，加之患者本身生理及心理因素的改变 [1, 2]，肿瘤患者进食减少，代谢改变，使营养不良成为肿瘤患者的常见并发症 [3]，也是恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一 [4, 5]。营养不良是一种综合征，包括能量及营养素代谢的多个环节障碍 [6]，导致恶液质的发生，机体逐渐出现显著消瘦、贫血、精神衰弱等全身机能衰竭的现象 [7, 8]，严重影响患者的生存质量，增加患者及其家庭的经济负担 [9]，因而，合理的营养治疗已成为提高肿瘤综合治疗疗效的重要环节。乳清蛋白是乳类的主要成分，其氨基酸模式符合人体需要。

缓冲液、DMEM 高糖培养基、青 - 链双抗（美国 Hyclone 公司），胰蛋白酶、胎牛血清（美国 Gibco 公司），ABD 活性因子（含 90% 乳清蛋白，美睿健康产业（重庆）有限公司），黄豆蛋白粉（80% 黄豆蛋白，美国），谷胱甘肽检测试剂盒（碧云天）。

人胰腺癌 panc-1 细胞购买于中国科学院细胞库。

4 周龄雄性 BALB/C（nu/nu）品系裸小鼠30 只，购于上海灵畅生物科技有限公司 [ 动物许可证编号：SCXK（沪）2013-0018]，饲养于第二军医大学公共卫生学院实验动物中心 SPF 级环境中。

panc-1 细胞用 DMEM 培养基（含 10% 胎牛血清和 100U/ml 的青链霉素）在 5%CO2、37℃培养箱中培养，隔天换培养液，胰蛋白酶消化传代。

30只裸鼠适应性生长 1 周后，取对数生长期的胰腺癌细胞 panc-1，用 PBS 调整细胞浓度为 1×107/300μl 左右，于小鼠的右后支背部皮下接种细胞悬液 300μl，12天长出移植瘤，用游标卡尺测量肿瘤直径，按照Ｖ＝ ab2π/6（a 为最大直径，ｂ为最小直径）计算肿瘤，用游标卡尺测量肿瘤直径，按照Ｖ＝ ab2π/6（a 为最大直径，ｂ为最小直径）计算肿瘤体积，当瘤体积达到 80mm3 时进行实验。按移植瘤瘤体大小随机分组，每组8 只：正常饮食（stan-dard diet，SD）组，黄豆蛋白（Soy）组，ABD 活性因子（ABD）组，植物蛋白粉和乳清蛋白粉分别加入灭菌饮用水中，浓度为 120mg/ml，早晚各换水一次，经过前期观察记录及查阅文献，裸鼠每日饮水量 5ml 左右，因而蛋白摄入量在 600mg 左右。

整个实验过程每天观察裸鼠活动状态，每周测量裸鼠体质量、瘤体大小，实验终点心脏取血、取瘤，测量血液及瘤组织中 GSH 含量。根据说明书具体方法如下：组织样品液氮速冻，研磨成粉末，对于新鲜血液样本，600g 离心 10 分钟后，加入蛋白去除试剂 S 溶液充分匀浆，4℃放置 10 分钟后，10,000g 4ºC 离心 10 分钟，取上清用于总谷胱甘肽的测定。将准备好的上清依次加入 96 孔板，然后每孔加入 150μl 总 GSH 检测工作液混匀，室温孵育 5 分钟，加入 50μl 0.5mg/ml NADPH 溶液，混匀。立即用酶标仪测定 A410，对照标准曲线计算总 GSH 含量，血液样品以 μmol/L 血浆为单位表示，组织样品以 μg/g 组织为单位表示。

应用 SPSS 16.0 统计软件进行统计学处理。统计数据用均数 ± 标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析比较组间差异，组间两两比较采用 q 检验，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

实验干预第 6 周开始 SD 组小鼠活动度逐渐降低，皮肤干燥，蜕皮现象严重，Soy 组亦少动，而 ABD 组小鼠皮肤光滑红润，活动度没有明显下降。第 6 周开始三组荷瘤鼠体重均出现明显下降，但 ABD 组体重下降要缓于 SD 组和 Soy 组，至第 8 周 ABD 组裸鼠体重（24.35±1.89）g 显著高于 SD 组（20.04±2.41）g 和 Soy 组（19.24±2.40）g（P ＜ 0.05），见图 1A、图1B。

移植瘤接种成功后各组肿瘤体积呈逐步上升趋势，三组间差别无统计学意义（P ＞ 0.05），见图 2A。至实验终点，SD组瘤组织质量为（2.43±0.14）g，Roy 组（2.21±0.29）g，ABD 组（2.30±0.23）g，三组差别无统计学意义，见图 2B。

图 1 裸鼠一般状态及体重变化

至实验终点，SD 组于第 7 周死亡 2 只，第 9 周死亡 4 只、存活 2 只，生存率为 25%，平均生存时间为（56.00±5.29）天 ；Roy 组分别于第 6、8 周死亡 2 只，第 9 周死亡 1 只、存活 3 只，生存率 37.5%，平均生存时间为（51.63±10.54）天；ABD 组于第 9 周死亡 1 只，存活 7 只，生存率为87.5%，平均生存时间为（62.13±2.47）天，见图 3。生存分析结果显示，ABD 组平均生存时间明显高于 Roy 组和 SD 组（P ＜ 0.05），Roy 组平均生存时间低于 SD 组但差别无统计学意义（P ＞ 0.05）。

GSH 广泛存在于动植物中，具有抗氧化和增强机体免疫力等作用。本研究检测了血液及瘤组织中 GSH 含量，单因素方差分析结果显示，三组裸鼠血液中 GSH 含量差别有统计学意义（P ＜ 0.01），ABD 组 GSH 含量明显高于 Roy 组和SD 组（P ＜ 0.01），见图 4A。三组瘤组织中 GSH含量分别是：SD 组（914.18±57.98）μg/g、Soy 组（915.11±72.41）μg/g 和 ABD 组（858.10±32.56）μg/g，结果表明 ABD 组肿瘤组织中 GSH 低于 Roy 组和 SD 组，但差别无统计学意义 P ＞ 0.05，见图 4B。

图２ 肿瘤体积及瘤体质量

图 3 不同干预方式下裸鼠生存曲线

由于肿瘤本身及抗肿瘤治疗的影响，肿瘤患者营养不良的发生率高达 40%~80%[12]，然而这些患者营养治疗率却很低，因此造成住院时间延长，住院费用增加以及生活质量降低，并且严重影响临床预后 [9, 13]。因而，了解肿瘤患者的营养状况，予以积极妥善的营养干预是改善肿瘤临床结局的重要措施。乳清蛋白含多种活性成分，必需氨基酸组成与人体需要量模式相近，富含支链氨基酸，尤其是亮氨酸，而亮氨酸对于促进骨骼肌合成、增加肌肉体积、降低 TNF-α 水平、增加胰岛素敏感性 [14, 15]、改善恶液质状况具有重要作用 [16, 17]。

图 4 GSH 水平比较

乳清蛋白还富含人体所需的钙、铁、镁等多种微量元素，能够显著改善人体的营养状态。许多研究表明，乳清蛋白及其衍生物（浓缩、分离、水解产物等）除了改善营养状态，还具有多种抗癌、抗氧化、抗炎等多种生理效应 [18]，见图 5。本研究应用的活性乳清蛋白，源自天然新鲜牛乳，采用低温专利萃取技术，保存了具有高生物活性的乳清蛋白，其蛋白含量高达 90% 以上，普通乳清蛋白其蛋白含量一般在 80% 左右。通常认为，蛋白质主要在肠道分解为游离氨基酸后被小肠黏膜吸收，但早在 20 世纪 70 年代，Gardner ML[19] 等就证实，短肽经肠道吸收的效率超过游离氨基酸，之后大量研究表明，蛋白质消化吸收是双通道模式，即短肽和游离氨基酸，且其中 60% 左右是以短肽吸收的。研究显示，活性乳清蛋白（ABD）含有许多活性肽 [20, 21]，可以直接吸收进入机体发挥作用。这表明活性乳清蛋白吸收利用效率可能高于普通乳清蛋白。

图 5 乳清蛋白主要成分及其应用

本研究通过建立裸鼠胰腺癌模型，初步探讨活性乳清蛋白对荷瘤小鼠营养治疗效果，结果显示，活性乳清蛋白虽然未抑制瘤组织的生长，但能明显改善裸鼠生活状态，延长荷瘤鼠的生存期，这可能与活性乳清蛋白延缓荷瘤鼠体重下降、减轻恶液质的发生有关。

同时，我们发现，ABD 组除了改善一般营养状况之外能显著提高裸鼠血液中GSH 含量，这表明活性乳清蛋白通过改善营养状况和增强抗氧化能力来提高机体抵抗力。氧化应激是肿瘤发生的一个常见因素，几乎所有肿瘤中均存在细胞内氧化 - 抗氧化体系的失衡 [19, 22]，GSH 不仅能消除人体自由基发挥抗氧化作用 [23]，同时还能增加 T 细胞活力，并完善免疫系统，提高人体免疫力 [24]，这可能是延长 ABD 组裸鼠生存期的重要因素。有研究发现，乳清蛋白中的 α- 乳白蛋白、β- 乳球蛋白等成分具调节特异性免疫应答的功能，可直接激活中性粒细胞的产生，聚集 IL-6、IL-8 等趋化因子和某些细胞因子，从而增强抗炎效果和提高患者免疫力 [25]， Badr G 等 [26] 在动物实验中同样发现，乳清蛋白治疗组血浆 IL-1α、IL-1β、IL-10、TNF-α、氧自由基以及胆固醇水平显著低于对照组，而 IL-2，IL-4，IL-7，IL-8 和 GSH 水平却显著增加，此外，可应对不同抗原刺激的淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等增殖能力明显增强，炎症是肿瘤发生、发展公认的诱发因素之一，目前慢性炎症被认为是人类肿瘤的重要特征[27, 28]，活性乳清蛋白因子通过增强机体抗炎能力，一定程度上发挥抗肿瘤作用。

许多研究发现，肿瘤细胞中GSH 含量较高，这与其应对自身氧化应激、获得快速增殖有关 [29, 30]。同时，本研究检测瘤组织中 GSH 含量发现 ABD 组瘤组织中 GSH 含量反而降低，但与其它两组差别没有统计意义。早前 Baruchel S 等 [31] 研究表明，由于丧失正常新陈代谢的功能，所以癌细胞不能进行正常的 GSH 代谢，当暴露在大量 GSH 前体物质 -- ABD 活性因子时，由于“负反馈机制”会减少肿瘤细胞内 GSH 的合成，而正常细胞可以不断生成GSH，这种选择性调节 GSH 合成的作用可以在保护正常细胞的同时抑制癌细胞增殖。

营养不良、体重减轻以及机体免疫功能下降是肿瘤及其治疗过程中常见的不良反应 [32, 33]，积极妥善的营养治疗一方面能够改善生活质量，延长生存期 [34, 35]，另一方面可增强放化疗的耐受性及敏感性 [36]。此外，适当的营养干预有可能通过调节肿瘤细胞的异常代谢达到抑制肿瘤生长的目的[37]。 ABD 活性因子能够改善营养状况，不断生成和补充活性 GSH，发挥抗氧化、增强免疫功能等作用，改善生活质量，延长生存时间，可作为临床肿瘤患者治疗过程中良好的营养补充剂，然而，其具体的机制仍需进一步实验阐明。